Protokoll Des Elektronenmikroskops Mit Negativer Färbung Bei Hautausschlagkrankheiten - Pocken

2023 Autor: Stephanie Arnold | [email protected]. Zuletzt bearbeitet: 2023-11-26 09:29

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Einführung

Die elektronenmikroskopische (EM) Visualisierung von negativ gefärbten Pockenvirusvirionen war eine wertvolle Technik zur Bestätigung von Pockenvirusinfektionen während der Pockenbekämpfungskampagne. In der Vergangenheit konnten bei etwa 95% der klinischen Proben von Patienten mit Orthopoxvirus-Infektionen wie Variola (Pocken) / Affenpocken und bei etwa 65% von Patienten mit Vaccinia (Pockenimpfstoff) Pockenviruspartikel mit negativer Färbung erfolgreich nachgewiesen werden. Im Falle einer absichtlichen Freisetzung des Pockenvirus und einer anschließenden Erkrankung des Menschen oder bei generalisierten Vaccinia-Infektionen infolge einer Impfung wären negativ gefärbte Präparate, die aus Läsionen oder Schorfmaterial stammen, wiederum eine wertvolle Methode zur Unterstützung der Pockenvirusdiagnose und / oder zum Ausschluss anderer Ursachen für Hautausschläge. Die EM-Visualisierung von Virionen, die mit einem Pockenvirus kompatibel sind, allein würde jedoch keinen Beweis für eine Pockeninfektion darstellen, da verschiedene Pockenviren wie Variola-, Vaccinia-, Monkeypox- und Molluscum-Viren (Molluscipoxvirus) morphologisch nicht unterscheidbar sind.

Während EM-Labors integrale Mitglieder des Biopräparations-Teams sein werden, sollten einige Aspekte berücksichtigt werden, bevor ein EM-Labor sich bereit erklärt, Proben von Patienten mit Verdacht auf Pockenvirus-Infektion zu verarbeiten. Zunächst sind die diagnostischen Fähigkeiten des Laborpersonals zu berücksichtigen, das Erfahrung mit der Herstellung von EM-Gittern mit negativen Färbungen haben sollte und, was noch wichtiger ist, Erfahrung mit der Analyse von EM-Präparaten mit negativen Färbungen haben sollte, um die Virusmorphologie zu identifizieren und diese von ähnlichen zu unterscheiden und Artefakte. Zweitens muss EM-Personal, das mit Proben umgeht, kürzlich geimpft worden sein oder keine Kontraindikationen für eine Impfung nach Exposition haben. Schließlich muss das EM-Labor Zugang zu einer BSL-3-Rückhalteeinrichtung oder einer BSL-2-Einrichtung haben, in der BSL-3-Vorsichtsmaßnahmen angewendet werden können.

EM-Labors, die an der Diagnostik von Viren mit negativer Färbung beteiligt sind, werden aufgefordert, am externen Qualitätsbewertungsprogramm External teilzunehmen, das vom Robert Koch-Institut in Berlin verwaltet wird. Die Schulung heißt „EQA-EMV (Externes Qualitätssicherungssystem in der Elektronenmikroskopie-Virendiagnostik) - Ringtest-Elektronenmikroskop-Virendiagnostik“.

Berichterstattung und angemessene Maßnahmen

1. Klinische Proben vor dem Ereignis mit hohem Verdacht auf das Vorhandensein von Variola-Virus, wie im Protokoll über akute, generalisierte vesikuläre oder pustulöse Hautausschläge beschrieben, sollten unverzüglich zur speziellen diagnostischen Bewertung an CDC weitergeleitet werden. Bei CDC werden mehrere Tests durchgeführt, um eine Pockeninfektion zu bestätigen oder auszuschließen, da ein positives Ergebnis für Pocken eine sofortige und umfassende Reaktion auf die öffentliche Gesundheit auslösen würde.
2. Details finden Sie auf der CDC-Pocken-Homepage.

Materialien

Akzeptable Proben von Läsionen

• Vesikuläre Flüssigkeit im EM-Netz
• Bläschenflüssigkeit als Abstriche auf Objektträgern
• Krusten und Gewebebiopsien
• Tupfer
• Vesikuläre Flüssigkeit in einer Tuberkulin-Spritze oder einem anderen kollektiven Gerät

Diese Sammelvorrichtungen sollten in einem versiegelten Kunststoffbehälter versandt werden, um ein Verschütten zu vermeiden. Bei Verwendung von Nadel und Spritze sind Sicherheitsvorkehrungen erforderlich. Wenden Sie sich an Ihren örtlichen Sicherheitsbeauftragten.

Reagenzien

• Phosphorwolframsäure (Rezept siehe Abschnitt Negative Färbereagenzien)
• Uranylacetat (Rezept siehe Abschnitt Reagenzien für negative Flecken)
• Steriles entionisiertes Wasser (dH ₂ O)
• 1% Alcianblau (Sigma Aldrich)
• 2% Paraformaldehyd von EM-Qualität (Electron Microscopy Sciences), gepuffert mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS, pH 7, 3)
• Frisch hergestellte 1:10 Verdünnung von handelsüblichem Bleichmittel (Natriumhypochlorit)

Lieferungen

• Formvar-kohlenstoffbeschichtete 400-Mesh-Kupfergitter (Electron Microscopy Sciences) (Bei diesen Gittern ist die glänzende Seite mit Kunststoff beschichtet.)
• Gitteraufbewahrungsbox (Electron Microscopy Sciences)
• Parafilm
• 1-cm³-Spritze (für Schritt II. B.9.)
• Spritzenfilter (für Schritt II. B.9.)
• Stößel- und Mühlenrohrset (Fisher Scientific)
• Tupfextraktionsrohrsystem (Roche Applied Science)
• Mikrozentrifugenröhrchen mit O-Ring
• Mullkissen, eingeweicht in frisch zubereiteter 1:10 Lösung von handelsüblichem Bleichmittel
• Optional für die alternative Tupfervorbereitung (siehe Schritt ID2): Konische Zentrifugenröhrchen, Kunststoff, 15 ml; Spritze, Kunststoff, 3 cm³; Applikatorstift aus Holz
• Falls erforderlich, zur UV-Bestrahlung und Bleichinaktivierung (siehe Schritt III. A.): Petrischalen, Kunststoff, 60 x 15 mm und 100 x 15 mm; Filterpapier, rund, 55 mm.

Ausrüstung

• Transmissionselektronenmikroskop
• Pinzette, EM-Qualität (Beispiele sind: Ted Pella, Inc. und Electron Microscopy Sciences)
• Mikrozentrifuge (siehe Schritt IC3.)
• Tischzentrifuge (siehe Schritt ID2. (F))
• Optional für die Viruskonzentration (siehe Schritt IF): Airfuge (Beckman Instruments)
• Optional für die alternative Netzvorbereitung (siehe Schritt II. A.2.): Glimmentladungseinheit und Vakuumpumpe (Ted Pella, Inc.). Alternativ kann im Labor eine Glimmentladungseinheit gemäß dem von Aebi und Pollard beschriebenen Design konstruiert werden (siehe Referenzen).
• Falls erforderlich, zur UV-Bestrahlung und Bleichinaktivierung (siehe Schritt III. A.): Germizide UV-Lampen der E-Serie, Lampenständer, UV-Messgerät, UV-Schutzbrille (Spectroline)

Materialquellen

Beckman InstrumentsExternal Tel: (800) 742-2345

Electron Microscopy SciencesExternal Tel: (800) 523-5874

Fisher ScientificExternal Tel.: (800) 766-7000

Roche Applied ScienceExternal Tel.: (800) 262-1640

Sigma-AldrichExtern Tel: (800) 325-3010

SpectrolineExternal Tel: (800) 274-8888

Ted Pella, Inc. Extern Tel: (800) 237-3526

Haftungsausschluss:

Namen von Anbietern oder Herstellern werden als Beispiele für geeignete Produktquellen angegeben. Die Aufnahme bedeutet nicht, dass die Zentren für die Kontrolle und Prävention von Krankheiten oder das Ministerium für Gesundheit und menschliche Dienste dies befürworten.

Negatives Färbeverfahren

Negative Färbereagenzien

• 2% Phosphorwolframsäure (PTA):

  • 2 g Phosphorwolframsäure in 100 ml dH ₂ 0
  • pH bis 7, 0 mit KOH
  • Bei 2 bis 8 ° C lagern

• 0, 5% Uranylacetat (UA):

  • 0, 5 g Uranylacetat in 100 ml dH ₂ 0
  • Über Nacht stehen lassen
  • Bei 2 bis 8 ° C im Dunkeln lagern

1. Probenvorbereitung

   Alle nicht fixierten Materialien von Proben mit hohem Risiko sollten im BSL-3 manipuliert werden.

   Hinweis: Bereiten Sie nach Möglichkeit mindestens 2 Gitter pro Probe vor. Wenn das Material im EM-Gitter zu dicht ist, verdünnen Sie die Probe mit dH ₂ O und erstellen Sie neue Gitter.

2. Vesikuläre Flüssigkeit auf EM-Gittern, die zuvor mit der Direktberührungsmethode hergestellt wurden:

   Fahren Sie mit Schritt II. B.9 fort

3. Vesikuläre Flüssigkeit als Abstriche auf Objektträgern:

   1. Fügen Sie 1-2 Tropfen steriles dH ₂ 0 hinzu.
   2. Zum Resuspendieren trockenes Material zerkratzen.
   3. Stellen Sie EM-Gitter direkt von diesem Material her (siehe Schritt II.)
   4. Übertragen Sie die verbleibende Flüssigkeit zur Lagerung / weiteren Prüfung in ein Mikrozentrifugenröhrchen.

4. Krusten- und Gewebebiopsie (Stößel und Schleifrohr verwenden):

   1. Legen Sie die Kruste in das Tissue Grinder-Röhrchen und geben Sie 1 ml steriles dH ₂ 0 hinzu.
   2. Mahlen, um eine opaleszierende Suspension herzustellen.
   3. 5 Minuten bei 1.000 xg zentrifugieren.
   4. Verwenden Sie den Überstand als Probe für Schritt II.

5. Tupfer

   1. Befolgen Sie entweder die Anweisungen für das Tupfer-Extraktionsrohrsystem (Roche).

   2. Oder befolgen Sie die alternativen Verfahren (unten):

      1. Legen Sie den Tupfer in ein konisches 15-ml-Röhrchen, das ungefähr 0, 3 ml steriles dH ₂ 0 enthält.
      2. 10 bis 15 Minuten einweichen.
      3. Kratzen Sie mit einem hölzernen Applikatorstift alle verbleibenden Proben vom Wattestäbchen direkt in das dH ₂ 0.
      4. Entfernen Sie den Tupfer vorübergehend aus dem Zentrifugenröhrchen. Setzen Sie den Zylinder nur einer 3-ml-Spritze in das konische 15-ml-Röhrchen ein und legen Sie den Tupfer in den Spritzenzylinder. Stock abbrechen. Kappe aufschrauben, um Aerosolisierung zu vermeiden.
      5. Setzen Sie das konische Rohr in einen Zentrifugenbehälter in einem Aerosolbarriere-Rotor.
      6. 20 Minuten bei 2.000 xg zentrifugieren.
      7. Setzen Sie den gesamten Zentrifugenbehälter wieder in BSC ein. Entfernen Sie das konische Rohr aus dem Kanister.
      8. Entfernen Sie den Tupfer und den Spritzenzylinder und entsorgen Sie ihn in einem weggeworfenen Behälter, der eine 1:10 Verdünnung von handelsüblichem Bleichmittel enthält.
      9. Sediment resuspendieren. Verwenden Sie die resultierende Flüssigkeit als Probe für Schritt II.

6. Vesikuläre Flüssigkeit in Sammelgeräten (z. B. Spritze, Kapillarröhrchen usw.)

   1. Flüssigkeit in das Mikrozentrifugenröhrchen ausstoßen.
   2. Legen Sie zwei 2 bis 5 μl Probentropfen auf eine Parafilmfolie. (Bewahren Sie die verbleibende Flüssigkeit für zusätzliche Tests auf.)
   3. Verdünne den 2. Tropfen durch Zugabe einer gleichen Menge dH ₂ 0 und Mischen.
   4. Fahren Sie mit Schritt II fort.
   5. Bewahren Sie die verbleibende Probe zur Lagerung / weiteren Prüfung im Mikrozentrifugenröhrchen auf.

7. Viruskonzentration (optional):

   1. Falls verfügbar, kann eine Luftfuge verwendet werden, um das Virus in Proben aus Schritt IB3 zu konzentrieren. (Bläschenflüssigkeit als Abstriche auf Objektträgern), Schritt IC4. (Krusten und Gewebebiopsien) und Schritt ID1. Oder ID2. (I). (Tupfer).
   2. Schleudern Sie die Proben 30 Minuten lang mit 30 lb / in ², dekantieren Sie den Überstand in eine Abfallpfanne, die frisch verdünnte Bleichlösung enthält, resuspendieren Sie das Pellet in 10 bis 20 μl dH ₂ 0 und verwenden Sie Flüssigkeit als Probe für Schritt II.

8. EM-Netzverarbeitung nach der Drop-to-Drop-Methode

   Machen Sie nach Möglichkeit mindestens 2 Probengitter.

   1. Verbesserung der Hydrophilie von EM-Gittern:

      1. Legen Sie kunststoff- / kohlenstoffbeschichtete Gitter (Kunststoffseite nach unten) 5 Minuten lang auf einen Tropfen 1% Alcianblau und spülen Sie sie dann mit 3 Tropfen dH ₂ O ab.
      2. Alternativ können Sie, falls verfügbar, eine Glimmentladungsbehandlung für Gitter unmittelbar vor dem Aufbringen des Gitters auf den Probentropfen verwenden.

   2. Drop-to-Drop-Methode (siehe Abb. 1):

      1. 5 μl flüssige Probe auf eine Parafilmfolie geben.
      2. HINWEIS: Um eine Kreuzkontamination zu vermeiden, verwenden Sie für jede Probe eine andere Pinzette.
      3. Legen Sie ein mit Kunststoff / Kohlenstoff beschichtetes 400-Mesh-Kupfergitter (mit der Kunststoffseite nach unten) auf den Tropfen und lassen Sie es 10 Minuten lang einziehen.
      4. Überschüssige Flüssigkeit mit Filterpapier abwischen.
      5. Legen Sie das Gitter 5 Minuten lang in einen großen Tropfen gepufferten 2% igen Paraformaldehyds.
      6. Überschüssige Flüssigkeit mit Filterpapier abwischen.
      7. In 2 Tropfen dH ₂ O spülen.
      8. Überschüssige Flüssigkeit mit Filterpapier abwischen.

      9. Beflecken.

         1. Flecken können in 1-cm³-Spritzen mit Spritzenfiltern aufbewahrt werden. Decken Sie die Spritze mit 0, 5% UA in Folie ab, um Licht auszuschließen.
         2. Legen Sie das Gitter (mit der Plastikseite nach unten) auf einen Tropfen gefilterten 2% PTA, pH 7, 0, und lassen Sie es ca. 30 Sekunden lang färben.
         3. Wenn das 2. ^Probenraster verfügbar ist, färben Sie es ungefähr 30 Sekunden lang mit gefilterten 0, 5% UA.
      10. Überschüssige Flüssigkeit mit Filterpapier abwischen.
      11. Wenn Sie mit Schritt III. A. fortfahren, legen Sie die Gitter in den Boden einer 60 x 15 mm großen Plastik-Petrischale, die ein rundes Filterpapier enthält. Fahren Sie andernfalls mit Schritt III. B fort.

Abbildung 1: Darstellung der Drop-to-Drop-Methode in Abschnitt II. B für zuvor fixierte Proben.

Adaptiert von FW Doane und N Anderson, Elektronenmikroskopie in der diagnostischen Virologie.

1. Inaktivierung

   Hinweis: Inaktivieren Sie Gitter im biologischen Sicherheitsschrank.

   1. UV-Bestrahlung und Bleichinaktivierung (siehe Abb. 2)

      Hinweis: Diese Schritte unter Verwendung von UV-Bestrahlung und Bleichmittel sind nur für Proben erforderlich, die als hohes Risiko für das Variola-Virus eingestuft wurden. (Weitere Informationen zur Bewertung des Probenrisikos finden Sie unter Diagnose und Bewertung.) Sie werden verwendet, um die Inaktivierung von Viruspartikeln sicherzustellen, einschließlich solcher auf dem Filterpapier oder auf der Außenseite der Petrischale.

      1. Geben Sie eine frisch zubereitete 1:10 Verdünnung des handelsüblichen Bleichmittels in eine 100 x 15 mm große Petrischale, gerade genug, um den Boden der Schale zu bedecken (ca. 50 ml).
      2. Legen Sie den Boden der Petrischale (mit Gittern) in die größere Schale.
      3. Unter UV-Licht (254 nm Wellenlänge) stellen und 10 Minuten bestrahlen.
      4. Drehen Sie die Gitter um und bestrahlen Sie weitere 10 Minuten.

Abbildung 2: UV-Bestrahlung und Bleichinaktivierung (siehe Schritt III. A.). Bild der in Schritt III. A beschriebenen Ausrüstung zur Inaktivierung von Proben mittels UV-Bestrahlung und Bleichinaktivierung.

1. Legen Sie die Gitter mit einer sauberen Pinzette in die Gitterbox. Notieren Sie sorgfältig, welcher Steckplatz für jede Patientenprobe verwendet wird. Alle verwendeten EM-Pinzetten sollten mit Gaze dekontaminiert werden, die mit einer 1:10 Bleichlösung gesättigt ist

Interpretation der Ergebnisse

Pockenviren, ausgenommen Parapoxviren

Die Virionen messen ungefähr 225 x 300 nm und erscheinen in Längsrichtung rechteckig oder ziegelsteinförmig und am Ende kreisförmig oder eiförmig. Abhängig vom Eindringen des Flecks können zwei Formen gesehen werden. In der Form „M“(oder „Maulbeere“) ist die Oberfläche mit kurzen, quirligen Filamenten bedeckt, und manchmal ist in der Mitte des Virions eine kreisförmige Vertiefung zu sehen. In Partikeln, die von Flecken durchdrungen sind, der "C" - oder ("Kapsel") - Form, sind Oberflächenfilamente nicht sichtbar; Stattdessen besteht das Virion aus einem scharf definierten, dichten Kern, der von mehreren laminierten Zonen unterschiedlicher Dichte umgeben ist. Außerdem werden manchmal umhüllte Partikel gefunden.

3: EM des Vaccinia-Virus aus Gewebekultur (A). EM des Vaccinia-Virus aus der klinischen Probe (B). EM des Monkeypox-Virus aus der klinischen Probe (C). Es ist zu beachten, dass in klinischen Proben die Morphologie möglicherweise weniger ausgeprägt ist als in Gewebekulturproben.

4: EM des Geflügelpockenvirus, Gewebekulturprobe, zeigt 3 Virionen mit "C" -Form (A). EM des Tanapox-Virus, klinische Probe (umhülltes Virion) (B).

Parapoxviren (zB Orf)

Parapoxvirus-Partikel erscheinen eiförmiger als andere Pockenviren, und die Oberflächenfilamente sind spiralförmig oder kreuz und quer angeordnet. Die Partikel messen ungefähr 150 x 200 nm.

5 EM des Parapoxvirus (Orf-Virus) aus Gewebekultur (A) und klinischer Probe (B). Elektronenmikroskopische Aufnahmen des Parapox-Virus aus Gewebekultur und klinischer Probe.

Herpesviren (z. B. Varicella-Zoster-Virus, Herpes-simplex-Viren Typ 1 und Typ 2)

Das nackte Nucleocapsid mit einem Durchmesser von ungefähr 100 nm besteht aus einem Ikosaeder, das aus hohlen Kapsomeren besteht. In Flecken eingedrungene Nukleokapside können das Aussehen eines von den hohlen Kapsomeren umrandeten Sechsecks haben. Umhüllte Virionen können identifiziert werden, wenn der Fleck die Virushülle durchdringt und das Nukleokapsid umreißt.

6: Zwei Bilder von Herpesvirus-Partikeln aus Gewebekultur. Umhüllte Virionen (A). Nackte Nukleokapside, umrandet von hohlen Kapsomeren (B).

Abbildung 7: Zwei Bilder von Herpesvirus aus klinischen Proben. Herpesvirus aus klinischen Proben. Es ist zu beachten, dass in klinischen Proben die Morphologie möglicherweise weniger ausgeprägt ist als in Gewebekulturproben.

Es ist zu beachten, dass in klinischen Proben die Morphologie möglicherweise weniger ausgeprägt ist als in Gewebekulturproben.

Melanosomen

Es muss darauf geachtet werden, zwischen Pockenviruspartikeln und dieser in normaler Haut vorkommenden Struktur zu unterscheiden. Melanosomen kommen in Hautepidermis und Haarwurzeln vor und haben einen Durchmesser von etwa 370 nm und eine Länge von 0, 7 bis 1, 15 um.

Abbildung 8: Zwei EM-Bilder von Melanosomen.

Verweise

Abei U und Pollard TD. Eine Glimmentladungseinheit, um elektronenmikroskopische Gitter und andere Oberflächen hydrophil zu machen. Journal of Electron Microscopy Techniques. 1987; 7: 29 - 33.

Zentren für die Kontrolle und Prävention von Krankheiten. Pocken.

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