- Der Hämagglutinin-Inhibitionstest (HI-Test)
- Einschränkungen von HI-Tests
"Antigene" sind molekulare Strukturen auf der Oberfläche von Viren, die vom Immunsystem erkannt werden und eine Immunantwort auslösen können (Antikörperproduktion). Bei Influenzaviren befinden sich die Hauptantigene auf den Oberflächenproteinen des Virus (siehe Abbildung 1).
Wenn jemand einem Influenzavirus ausgesetzt ist (entweder durch Infektion oder Impfung), bildet sein Immunsystem spezifische Antikörper gegen die Antigene (Oberflächenproteine) dieses bestimmten Influenzavirus. Der Begriff "antigene Eigenschaften" wird verwendet, um den Antikörper oder die Immunantwort zu beschreiben, die durch die Antigene auf einem bestimmten Virus ausgelöst werden. "Antigene Charakterisierung" bezieht sich auf die Analyse der antigenen Eigenschaften eines Virus, um zu beurteilen, in welcher Beziehung es zu einem anderen Virus steht.
CDC charakterisiert jedes Jahr etwa 2.000 Influenzaviren antigenisch, um zu vergleichen, wie ähnlich die derzeit zirkulierenden Influenzaviren denen sind, die im Influenza-Impfstoff enthalten waren, und um Veränderungen der zirkulierenden Influenzaviren zu überwachen. Die antigene Charakterisierung kann einen Hinweis auf die Fähigkeit des Grippeimpfstoffs geben, eine Immunantwort gegen die in Menschen zirkulierenden Influenzaviren hervorzurufen. Diese Informationen helfen Experten auch bei der Entscheidung, welche Viren in den Influenza-Impfstoff der kommenden Saison aufgenommen werden sollen.
Andere Informationen, die bestimmen, wie ähnlich ein zirkulierendes Virus einem Impfvirus oder einem anderen Virus ist, sind das Ergebnis von Serologietests und genetischer Sequenzierung.
Abbildung 1. Influenzavirus-Funktionen
Bildsymbol
Das obige Bild zeigt die verschiedenen Merkmale eines Influenzavirus, einschließlich der Oberflächenproteine Hämagglutinin (HA) und Neuraminidase (NA). Nach einer Influenza-Infektion oder dem Erhalt des Influenza-Impfstoffs entwickelt das körpereigene Immunsystem Antikörper, die „antigene Stellen“erkennen und an diese binden. Dies sind Regionen, die sich auf den Oberflächenproteinen eines Influenzavirus befinden. Durch die Bindung an diese Antigenstellen neutralisieren Antikörper Grippeviren, wodurch verhindert wird, dass sie weitere Infektionen verursachen.
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Der Hämagglutinin-Inhibitionstest (HI-Test)
Wissenschaftler verwenden einen Test namens Hämagglutinin-Inhibitionstest (HI), um Influenzaviren antigenisch zu charakterisieren. Der HI-Test misst, wie gut Antikörper an Influenzaviren binden (und diese somit inaktivieren).
Wissenschaftler verwenden den HI-Test, um die antigene Ähnlichkeit zwischen Influenzaviren zu bewerten. Dieser Test ist besonders nützlich, um die Auswahl der im saisonalen Grippeimpfstoff verwendeten Impfviren zu erleichtern. HI-Testergebnisse können uns sagen, ob Antikörper, die gegen die Impfung mit einem Virus entwickelt wurden, einem anderen zirkulierenden Influenzavirus antigenisch ähnlich genug sind, um eine Immunantwort gegen dieses zirkulierende Virus hervorzurufen. Wissenschaftler verwenden den HI-Test auch, um antigene Veränderungen in derzeit zirkulierenden Influenzaviren mit Influenzaviren zu vergleichen, die in der Vergangenheit zirkuliert haben.
Der HI-Test umfasst drei Hauptkomponenten: Antikörper, Influenzavirus und rote Blutkörperchen, die in den Vertiefungen (dh Bechern) einer Mikrotiterplatte miteinander gemischt werden. (Siehe Bild 1.)
Bild 1. Eine Mikrotiterplatte
Eine Mikrotiterplatte wird verwendet, um den HI-Test durchzuführen. Die Platte enthält Vertiefungen (dh becherartige Vertiefungen, die eine kleine Menge Flüssigkeit aufnehmen können), in die die Lösung aus Antikörpern, Influenzavirus und roten Blutkörperchen eingeführt wird und interagieren kann. Diese Vertiefungen sind nach Zeilen und Spalten angeordnet (die auf der Mikrotiterplatte durch Buchstaben bzw. Zahlen gekennzeichnet sind). Die Reihen der Platte können verwendet werden, um verschiedene Influenzaviren gegen denselben Satz von Antikörpern zu testen. Die Säulen können verwendet werden, um zwischen größeren Verdünnungen von Antikörpern zu unterscheiden, beispielsweise einer Skala von niedrig nach hoch von links nach rechts (siehe 3 und 4 für ein Beispiel).
Die im HI-Test verwendeten Antikörper werden durch Infektion eines Tieres (normalerweise eines Frettchens) erhalten, das immunologisch naiv ist (dh es wurde zuvor in seinem Leben keinem Influenzavirus oder Impfstoff ausgesetzt). Das Immunsystem des Tieres erzeugt Antikörper als Reaktion auf die Antigene auf der Oberfläche des spezifischen Grippevirus, das zur Infektion dieses Tieres verwendet wurde. Um diese Antikörper zu untersuchen, wird dem Tier eine Blutprobe (Serum) entnommen. Der HI-Test misst, wie gut diese Antikörper andere Influenzaviren erkennen und an diese binden (z. B. Influenzaviren, die aus Grippepatienten isoliert wurden). Wenn die Frettchen-Antikörper (die aus der Exposition gegenüber dem Impfvirus resultierten) das Influenzavirus eines kranken Patienten erkennen und daran binden, weist dies darauf hin, dass das Impfvirus dem vom kranken Patienten erhaltenen Influenzavirus antigenisch ähnlich ist. Dieser Befund hat Auswirkungen darauf, wie gut der Impfstoff bei Menschen wirken könnte. Weitere Informationen finden Sie unter Wirksamkeit von Grippeimpfstoffen: Fragen und Antworten für Angehörige der Gesundheitsberufe.
Wie bereits erwähnt, werden die im HI-Test verwendeten Influenzaviren Proben von Kranken entnommen. CDC und andere WHO-Kooperationszentren sammeln Proben von Menschen auf der ganzen Welt, um zu verfolgen, welche Influenzaviren Menschen infizieren, und um zu überwachen, wie sich diese Viren verändern.
Für den HI-Test werden rote Blutkörperchen (RBCs) von Tieren (normalerweise Puten oder Meerschweinchen) entnommen. Sie werden im HI-Test verwendet, weil Influenzaviren an sie binden. Normalerweise sinken RBCs in einer Lösung auf den Boden der Testvertiefung und bilden am Boden einen roten Punkt (Abbildung 2A). Wenn jedoch ein Influenzavirus zu der RBC-Lösung hinzugefügt wird, binden die Hämagglutinin (HA) -Oberflächenproteine des Virus an mehrere RBCs. Wenn Influenzaviren an die Erythrozyten binden, bilden die roten Blutkörperchen eine Gitterstruktur (2B). Dies hält die Erythrozyten in Lösung suspendiert, anstatt auf den Boden zu sinken und den roten Punkt zu bilden. Der Prozess der Bindung des Influenzavirus an Erythrozyten zur Bildung der Gitterstruktur wird als "Hämagglutination" bezeichnet.
Abbildung 2. Komponenten des HI-Assays
Der HI-Test beinhaltet die Wechselwirkung von roten Blutkörperchen (RBCs), Antikörpern und Influenzaviren. Zeile A zeigt, dass RBCs in einer Lösung in Abwesenheit eines Virus auf den Boden einer Mikrotiterplatte sinken und wie ein roter Punkt aussehen. Zeile B zeigt, dass Influenzaviren an rote Blutkörperchen binden, wenn sie in dieselbe Lösung gegeben werden. Dies wird als Hämagglutination bezeichnet und wird durch die Bildung der Gitterstruktur dargestellt, die in der Spalte ganz rechts unter "Mikrotiter-Ergebnisse" dargestellt ist. Zeile C zeigt, wie Antikörper, die einem getesteten Virus antigenisch ähnlich sind, dieses Influenzavirus erkennen und daran binden. Dies verhindert die Bindung des Virus und der Erythrozyten, und daher tritt keine Hämagglutination auf (dh stattdessen tritt eine Hämagglutinationshemmung auf).
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Wenn Antikörper mit Influenzavirus vorgemischt werden, gefolgt von Erythrozyten, binden die Antikörper an Influenzavirus-Antigene, die sie erkennen, und bedecken das Virus, so dass seine HA-Oberflächenproteine nicht mehr an Erythrozyten binden können (2C). Die Reaktion zwischen dem Antikörper und dem Virus hemmt (dh verhindert) das Auftreten einer Hämagglutination, was zu einer Hämagglutinationshemmung führt (wie in 2C gezeigt). Aus diesem Grund wird der Assay als "Hämagglutinin-Hemmungstest (HI)" bezeichnet. Eine Hämagglutination (wie in 2B dargestellt) tritt auf, wenn Antikörper die Influenzaviren in der Lösung nicht erkennen und an diese binden, und infolgedessen binden die Influenzaviren an die roten Blutkörperchen in der Lösung und bilden die Gitterstruktur. Wenn die Antikörper die Influenzaviren in der Lösung erkennen und an diese binden, zeigt dies, dass das Impfvirus (wie das, mit dem die Frettchen infiziert wurden) eine Immunantwort gegen das vom kranken Patienten erhaltene Influenzavirus erzeugt hat. In diesem Fall soll das getestete Influenzavirus dem Influenzavirus, das die Antikörper (aus Frettchen) erzeugt hat, „antigenisch ähnlich“sein.
Wenn sich ein zirkulierendes Influenzavirus antigenisch von einem Impfstoff oder Referenzvirus unterscheidet, erkennen die Antikörper (die als Reaktion auf den Impfstoff oder das Referenzvirus entwickelt wurden) die Oberflächenantigene des zirkulierenden Influenzavirus nicht und binden nicht daran. Im HI-Test tritt dadurch eine Hämagglutination auf (siehe Abbildung 2B). Dies weist darauf hin, dass das Impfvirus oder Referenzvirus keine Immunantwort (dh die Bildung von Antikörpern) verursacht hat, die das zirkulierende Influenzavirus erkennt und darauf abzielt. Zirkulierende Influenzaviren, die über den HI-Test getestet wurden, werden typischerweise aus Atemwegsproben gewonnen, die von kranken Patienten entnommen wurden.
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Bewertung der antigenen Ähnlichkeit unter Verwendung des HI-Tests
Der HI-Test bewertet den Grad der antigenen Ähnlichkeit zwischen zwei Viren anhand einer Skala, die auf größeren Verdünnungen von Antikörpern basiert. Wie zuvor erwähnt, wird der HI-Test unter Verwendung einer Mikrotiterplatte durchgeführt. Die Mikrotiterplatte enthält Reihen und Spalten von Vertiefungen (dh Bechern), in denen Erythrozyten, Influenzaviren und Antikörper (entwickelt gegen ein Vergleichsvirus wie ein Impfvirus) gemischt werden. Verdünnungen sind oben auf der Mikrotiterplatte markiert. Diese Verdünnungen dienen als Skala zur Beurteilung der Ähnlichkeit von Antigenen und der Immunantwort. Durch Testen der Fähigkeit größerer Verdünnungen von Antikörpern, eine Hämagglutination zu verhindern, messen Wissenschaftler, wie gut diese Antikörper ein Influenzavirus erkennen und an dieses binden (und es daher inaktivieren). Je höher die Verdünnung, desto weniger Antikörper werden benötigt, um die Hämagglutination zu blockieren, und desto antigener sind die beiden verglichenen Viren einander ähnlich. Die höchste Verdünnung des Antikörpers, die zu einer Hämagglutinin-Hemmung führt, wird als HI-Titer eines Virus angesehen (Abbildung 3). Höhere HI-Titer sind mit einer größeren Ähnlichkeit der Antigene verbunden. Eine größere Ähnlichkeit der Antigene legt nahe, dass eine Impfung eine Immunantwort gegen das Testvirus hervorrufen würde.
Abbildung 3. HI-Titer-Assay
Diese Virusprobe hat einen HI-Titer von 1280, was bedeutet, dass die größte Verdünnung des Antikörpers, der das Auftreten der Hämagglutination noch blockierte, bei einer Verdünnung von 1280 lag. Bei dieser Verdünnung waren die Antikörper immer noch in der Lage, die Antigene auf dem Virus zu erkennen und an diese zu binden.
Abbildung 4. Antigen-Charakterisierungstest
Wenn CDC Influenzaviren antigen charakterisiert, um Entscheidungen über die Formulierung des saisonalen Grippeimpfstoffs zu treffen, wird der HI-Test verwendet, um derzeit zirkulierende Viren (B & C) mit Impfviren (A) zu vergleichen. Auf diese Weise können Wissenschaftler schnell feststellen, ob ein im saisonalen Grippeimpfstoff verwendetes Virus den zirkulierenden Influenzaviren antigenisch ähnlich ist und daher eine Immunantwort gegen sie auslösen kann.
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Experten des öffentlichen Gesundheitswesens betrachten Influenzaviren als antigenisch ähnlich oder „ähnlich“, wenn sich ihre HI-Titer um zwei Verdünnungen oder weniger unterscheiden. (Dies entspricht einer Differenz von zwei Vertiefungen (dh einer vierfachen Verdünnung) oder weniger). Am Beispiel von Abbildung 4 unterscheidet sich das zirkulierende Virus 1 beim Vergleich von zirkulierendem Virus 1 mit einem Impfvirus um eine Verdünnung (ein zweifacher Unterschied) und ist daher dem Impfvirus der vorherigen Saison „ähnlich“. Das zirkulierende Virus 2 unterscheidet sich jedoch um fünf Verdünnungen (ein 32-facher Unterschied) und ist daher nicht mit dem Impfvirus der vorherigen Saison vergleichbar. Zirkulierende Viren, die antigenisch unähnlich sind (dh nicht „wie“), werden als „niedrige Reaktoren“betrachtet.
Einschränkungen
Die Antigencharakterisierung liefert wichtige Informationen darüber, ob ein Impfstoff, der unter Verwendung eines bestimmten Impfvirus hergestellt wurde, vor zirkulierenden Influenzaviren schützt. Die Testmethode für die Antigencharakterisierung unterliegt jedoch mehreren Einschränkungen, die nachstehend beschrieben werden.
Ei Anpassungen
Derzeit werden die meisten Grippeimpfstoffe mit in Eiern gezüchteten Viren hergestellt. Wenn sich menschliche Influenzaviren an das Wachstum in Eiern anpassen, können genetische Veränderungen in den Viren auftreten. Diese werden als "eiadaptierte" Veränderungen bezeichnet. Einige an das Ei angepasste Veränderungen können die antigenen (oder immunogenen) Eigenschaften des Virus verändern, während andere dies möglicherweise nicht tun. Ei-angepasste Veränderungen sind zu einem besonderen Problem bei der Auswahl von Kandidaten-Impfviren (CVVs) für die Influenza A (H3N2) -Virus-Komponente des Grippeimpfstoffs geworden. Influenza A (H3N2) -Viren wachsen in Hühnereiern tendenziell weniger gut als Influenza A (H1N1) -Viren und sind auch anfälliger für eiadaptierte Veränderungen. Solche Veränderungen können den Immunschutz des Grippeimpfstoffs gegen zirkulierende A (H3N2) -Viren verringern.
Zeit von der Auswahl des Impfvirus bis zur Abgabe des Impfstoffs
Unter Verwendung der aktuellen Impfstoffproduktionstechnologie dauert es ungefähr 6-8 Monate von der Auswahl des Impfvirus (dh Februar für den Grippeimpfstoff der nördlichen Hemisphäre) bis zu dem Zeitpunkt, an dem Influenza-Impfstoffe allgemein verfügbar werden. Da sich Influenzaviren ständig ändern, können sich zirkulierende Influenzaviren in diesem Zeitraum von 6 bis 8 Monaten ändern. Wenn diese genetischen Veränderungen antigene Veränderungen verursachen, kann dies bedeuten, dass durch Impfung erzeugte Antikörper zirkulierende Influenzaviren möglicherweise nicht erkennen und inaktivieren. Neue Technologien zur Verkürzung der Herstellungszeit für die Herstellung von Influenza-Impfstoffen könnten die Wahrscheinlichkeit signifikanter Antigenveränderungen verringern, bevor Influenza-Impfstoffe jedes Jahr verfügbar werden.
